Uso de crioprotetores para a preservação de coleções microbianas mantidas para PD&I / Use of cryoprotectors for the preservation of microbial collections maintained for RD&I

Helena Carla Castro, Evelize Folly das Chagas, Maíra Halfen Teixeira Liberal, Clarissa Varajão Cardoso, Eunice Ventura Barbosa, Helena Magalhães

Resumo


O armazenamento de microrganismos por longos períodos é importante para a sua utilização em Pesquisa, Desenvolvimento & Inovação (PD&I). A correta preservação das cepas é fundamental para evitar contaminações e mutações, podendo levar à perda das características morfológicas, fisiológicas e genéticas. O Laboratório de Biotecnologia do CEPGM da PESAGRO-RIO realizaexames para o diagnóstico, a prevenção e o controle de enfermidades em animais de produção, e mantém a “Coleção de Microrganismos Patogênicos para Animais de Produção”. Até 2010 as cepas eram mantidas à -20ºC, sem crioprotetores. Porém em 2011 foi adquirido um ultrafreezer -80ºC, e 595 cepas congeladas à -20ºC foram reativadas e avaliadas quanto à viabilidade, identidade e pureza. Dessas, apenas 64 (10,76%) estavam viáveis. Desde então segue-se o protocolo de preservação à -80ºC, utilizando o Skim Milkcomercial com adição de 10% (p/v) glicerol, que são autoclavados separadamente a 121ºC/15min, e em seguida homogeneizados e acondicionados em criotubos de 3mL,levados ao freezer -20ºC por 2 dias, e posteriormente acondicionados no ultrafreezer -80ºC. Do total de 632 cepas bacterianas isoladas de 2011 a 2018, 442 cepas (69,93%) estão preservadas à -80ºCemSkim Milk com glicerol, e 190 (30,07%) à -20ºC em BHI com glicerol, para futuras pesquisas. Em 2016 e 2017 foram repicadas 427 cepas isoladas entre 2013 e 2015, que estavam mantidas à -80ºC, e 100% apresentaram-se viáveis. Os resultados indicam que o uso de crioprotetores favoreceu a preservação e a estabilidade das cepas, tanto no congelamento à - 80ºC como à -20ºC. 


Palavras-chave


Criopreservação, Skim Milk, Glicerol.

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Referências


ABREU, M. M.V. & TUTUNJI, V. L.Implantação e manutenção da coleção de culturas de microrganismos do UniCEUB. Universitas Ciênc. Saúde. 2003; 2 (2):236-251.

BRILHANTE, R. S. N.;CAVALCANTE, C. S. P.;SOARES-JUNIOR, F. A.;MONTEIRO, A. J.;BRITO, E.H. S.;CORDEIRO, R. A.;SIDRIM, J.J. C.;ROCHA, M.F.G. Evaluation of Microsporum canis in different methods of storage. Medical Mycology. 2004; 42:499-504.

COSTA, E.C. Conservação de amostras do vírus da Raiva mediante diferentes protocolos de criopreservação. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará. 2010;115p.

DAY, J. G. &MCLELLAN, M. R. Cryopreservacion and Freezing-Drying Protocols. New Jersey: Humana Press. 1995.

FIGUEIREDO, M. B. Métodos de preservação de fungos patogênicos. Biológico. 2001; 63 (1/2):73-82.

GIRÃO, M. D.;PRADO, M. R.;BRILHANTE, R.S. N.;CORDEIRO, R. A.;MONTEIRO, A. J.;SIDRIM, J.J. C.;ROCHA, M.F.G. Viabilidade de cepas de Malassezia pachydermatis mantidas em diferentes métodos de conservação. Rev Soc Bras Med Trop. 2004; 37 (3):229- 233.

HOLLAND, N. T.;SMITH, M. T.;ESKENAZI, B.;BASTAKI, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 2003; 543:217-234.

HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiol. 2003; 46(3):205-29.

KEITH, S. C. Factors influencing the survival of bacteria at temperatures in the vicinity of the freezing point of water. Science 1913; 37(962): 877–879. Disponível em:https://science.sciencemag.org/content/37/962/877/tab-article-info. Acesso em: 05 de junho de 2019.

LIBERAL, M. H. T.; SOUZA, R. de M.; MAGALHÃES, H. Aplicação da legislação brasileira de acesso e repartição de benefícios para o diagnóstico e a pesquisa epidemiológica de recursos genéticos microbianos de origem animal. In: FERREIRA, S. N.; SAMPAIO, M. J. A. M. (Org.).Biodiversidade e conhecimentos tradicionais associados: implementação da legislação de acesso e repartição de benefícios no Brasil.2013. SBPCSãoPaulo, 153-168.

MEDEIROS, A.W.; BECKER, A. P.; PICOLI, S.Acompanhamento de Métodos de Congelamento de Bactérias. 2009. NewsLab - edição 95.

MYAMOTO-SHINOHARA, Y.;IMAIZUMI, T.;SUKENOBE, J.;MURAKAMI, Y.;KAWAMURA, S.;KOMATSU, Y. Survival rate of microbes after freeze–drying and long-term storage. Cryobiol. 2000; 41:251-255.

OLIVEIRA, V. M.;SETTE, L. D.;FANTINATTI-GARBOGGINI, F. Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos. Divisão de Recursos Microbianos. Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA). Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP.2006; p.1-19.

OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, S.I.Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 2004; 2.ed. São Paulo, SP: Sarvier, 340 p.

PAOLI, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 2005; 29:897-910.

QUINN, P.J.;MARKEY, B. K.;CARTER, M. E.;DONNELLY, W. J.;LEONARD, F.C. Microbiologia e Doenças Infecciosas, Porto Alegre, Artmed. 2005; 512p.

SAEKI E. K.; FARHAT L. P.; PONTES, E. A. Eficiência dos crioprotetores glicerol e leite desnatado para o congelamento de micro-organismos.Acta Veterinaria Brasilica. 2015; v.9, n.2, p. 195-198.

SILVA, A.M. M.;BORBA, C. M.;OLIVEIRA, P.C. Viability and morphological alterations of Paracoccidioides brasiliensis strains preserved under mineral oil for long periods of time. Mycoses. 1994; 37:165-169.

SIMIONE, F. P. Cryopreservation Manual. Nalge International Coorp, 1998. Disponível em:http://www.nalgenelabware.com/techdata/technical/cryo.pdfAcesso em 05 de junho de 2019.

WESSMAN P.; MAHLIN, D.; AKHTAR, S.; RUBINO, S.; LEIFER, K.; KESSLER, V.; HAKANSSON, S. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J Sci Food Agric. 2011; 91(14):2518-28.


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